ELISA

ELISA (z ang. enzyme-linked immunosorbent assay) je metoda, která využívá sekundární protilátky a změnu barvy na detekci protilátek proti spermiím. Touto metodou není možné zjistit lokalizaci protilátek.
ELISA

ELISA někdy označovaná také jako EIA (Enzyme Immunoassay) je jednou z nejpoužívanějších imunologických metod sloužících k detekci protilátek. Metoda funguje na bázi imunoenzymatické reakce a lze s ní rovněž detekovat i antigen. ELISA využívá dvou základních vlastností imunoglobulinů. Za prvé je to schopnost proteinů (tedy imunoglobulinů) vázat se na povrch plastů (např. polystyrenu) a v druhé řadě pak schopnost vázat enzymy na Fc fragmenty (viz. protilátka) imunoglobulinových molekul.

Modifikace ELISA textu

Pro průkaz specifických protilátek i antigenů existuje široké spektrum různých modifikací ELISA testu:

přímá ELISA - pro detekci antigenu.
nepřímá ELISA - pro detekci specifických protilátek.
přímá sendvičová ELISA - pro detekci antigenu.
nepřímá sendvičová ELISA - pro detekci specifických protilátek.

Základní složky ELISA testu

Antigen

detekovaný v testovaném vzorku,
známý, komerčně připravovaný.

Protilátka

detekovaná v testovaném séru,
známá, komerčně připravovaná.

Konjugát

jedná se opět o protilátku proti protilátce (konkrétně proti druhově specifickým imunoglobulinům příslušného izotypu (proti IgG, IgM, IgA, viz protilátka), na kterou je navázaný enzym (konjugovaná enzymem).

Substrát

je chemická látka, která reaguje s enzymem a tím změní svou barvu.

Výhody

V porovnání s jinými imunologickými metodami existuje mnoho výhod ELISA. Výsledky ELISA testování jsou mnohem přesnější a jsou považovány za vysoce senzitivní a specifické a při testování se nemusí používat radioizotopy (radioaktivní látky).

vysoká citlivost (senzitivita)
- je to pravděpodobnost, že výsledek bude pozitivní,
- citlivost se hodnotí obvykle od 0 -10 nebo v %,
- vyjadřuje se úspěšnost, při níž se zachytí přítomnost sledovaného onemocnění.
vysoká specifičnost
- specifičnost se posuzuje vzhledem ke schopnosti selekce protilátek nebo antigenu,
- je to pravděpodobnost negativního výsledku u zdravé osoby,
- vyjadřuje schopnost testu najít případy, u kterých se onemocnění nevyskytuje.

Prostorové vybavení

Na vyšetřování pomocí ELISA metody je třeba zařízení, které se nazývá ELISA reader. Je to velký spektrofotometr, který dokáže měřit změny barev u chemických reakcích. Tyto přístroje se neustále vylepšují, aby byly výsledky testů co nejpřesnější.

Postup

Na povrch polystyrénové jamky je navázán antigen. Sérum, ve kterém hledáme protilátky, přidáme do jamky. Pokud je v séru protilátka, naváže se na antigen, který se drží pevně na povrchu jamky. Nenavázanou protilátku odplaví při promývání voda.
Přidáme další protilátku (komerční označenou barvičkou, nebo enzym) proti hledané protilátce v séru. Pokud je navázána na plotýnku přes antigen naváže se i komerční protilátka.
Tuto pak můžeme detekovat podle změny barvy.

ELISA test stanoví:

autoprotilátky - protilátky, které napadají buňky vlastního organismu.
specifické protilátky, které se vytvořily proti očkovacím² antigenům, proti infekčním činitelům (bakteriím, virům a parazitům).
cytokiny - jsou to látky, které regulují růst buněk, jejich zrání a dělení, jejich hodnoty jsou zvýšené i při zánětech.

Základem vyšetření je hodnocení a stanovení protilátek a antigenů ve vzorku. Protilátky jsou součástí imunitní reakce², jsou to bílkoviny, které produkuje organismus v obranné reakci proti škodlivým látkám (antigenům). Protilátky tedy bojují proti určitým antigenům. Metody pro zjišťování protilátek se neustále zlepšují a tak se dokáže přesně zjistit kvalita a kvantita zkoumané protilátky. Protilátka se vždy naváže na antigen, vytvářejí spolu komplex.

ELISA je analytická metoda, která se využívá ke stanovení různých antigenů. Metoda zahrnuje více reakcí, ale všechny typy reakcí jsou založeny na spojení protilátky a antigenu, přičemž na jeden z těchto substrátů se naváže enzym. Enzym ovlivňuje chemickou reakci tak, že změní barevný výsledek.

Při standardní sendvičové ELISE se zjišťuje koncentrace antigenu:

nejprve se na dno naváže zkoumaná protilátka, na kterou se má pak navázat antigen, který chceme najít a dokázat ve vzorku,
přidání vzorku - v této fázi vyšetření se vytváří vazba mezi antigenem a protilátkou pouze tehdy, pokud jde o hledaný antigen,
po vytvoření této vazby se spláchne nenavázaný antigen,
následně se přidá druhá protilátka, která také dokáže navázat antigen, ale na této protilátce je již navázán enzym, který barevně změní výsledek,
po ukončení reakce se vyhodnotí výsledky.

Název sendvičová je proto, že antigen je jako v sendviči mezi dvěma protilátkami. Tato reakce se dá uskutečnit i obráceně, čili hledá se protilátka proti známému antigenu.

Praktické použití

Metody ELISA se využívají k diagnostice infekčních nemocí lidí a zvířat. Stanovují se buď protilátky proti konkrétnímu patogenu nebo se detekují přímo prionové, virové, bakteriální nebo parazitární antigeny. Dále se používají k detekci některých toxinů, hormonů, celé řady proteinů, případně dalších bioaktivních látek. Vědci pracují i na vývoji metod ELISA pro kosmický výzkum, například k detekci forem života na Marsu.

ELISA a toxoplazmóza ELISA test se může použít pro diagnózu následujících onemocnění:

HIV virus- stanovuje se množství protilátek, které bojují proti viru HIV,
lymfská (mízní) nemoc,
perniciózní anémie (nedostatek červených krvinek způsobený nízkou hladinou vitamínu B 12),
rotaviry⁴,
rakovina - u rakoviny se detekují markery,
syfilis,
toxoplazmóza¹,
pomocí této metody lze odhalit i nelegální užívání drog, také se mohou odhalit různé alergické reakce na potraviny⁶, jako např. ořechy⁴ a mléčné produkty¹⁵.

Tento test doporučuje lékař při podezření na určitá onemocnění. Test se provádí i těhotným²⁴ ženám, v rámci screeningu na HIV pozitivitu. Pomocí ELISA³ se dají dokázat i protilátky proti spermiím¹ u mužů a tak se může zjistit příčina neplodnosti⁸.

Příprava na vyšetření

K vyšetření pacient nepotřebuje zvláštní přípravu. K vyšetření je zapotřebí pouze vzorek krve, který je pacientovi odebrán. Někteří pacienti mají z odběrů krve strach, je proto vhodné o tomto předem informovat lékaře.

Rizika

Existuje jen velmi malé množství rizik, které jsou spojeny s tímto testem. Žíly se u každého pacienta liší, proto odběr krve může být u některých pacientů obtížný.

Rizika jsou spojeny pouze s odběrem krve, mezi ně patří:

nadměrné krvácení,
nevolnost⁸, pocit na omdlení,
hematom⁴ - hromadění krve pod kůží (modřina),
infekce.

Výsledky

Pomocí ELISA testu se zjistí hladina koncentrace antigenu nebo protilátky. Zjistí se, zda je daná koncentrace v normě nebo ne. Na tomto základě se test vyhodnotí jako pozitivní nebo negativní. Vzhledem k tomu, že ELISA testy jsou velmi specifické a spolehlivé, lékaři tak mohou diagnostikovat onemocnění jako HIV, dá se identifikovat alergie nebo potvrdit těhotenství⁵.
ELISA a zjištění těhotenství